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乳液外泌体快速提取试剂盒

Exosome（外泌体）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；Exosome携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

本试剂盒采用独特的分离技术，可以快速从乳液中获得大量完整的外泌体颗粒，适用于下游的细胞共培养、电镜分析、Western Blot、荧光定量（qPCR）和高通量测序等应用。

产品组分

运输和保存方法

室温运输，室温保存，有效期2年。

注意事项

1、使用前请将外泌体抽提试剂（A）充分混匀。

2、产品只针对乳液样本，不适用其它血清/血液或者是细胞培养上清中外泌体的抽提；如果需要进行细胞上清外泌体分离，请选用细胞培养上清外泌体快速抽提试剂盒。

3、如果想要进一步纯化外泌体，可以使用相应抗体包被的磁珠进行亲和纯化。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5、本产品仅作科研用途！

操作方法

1.样品制备：

1）收集新鲜的样品，置于冰上待用；若为冻存的样品，可于冰箱取出后放于25℃水浴中解冻，待完全融化后置于冰上待用。

2）取20 mL（最佳提取样本量为50 mL）乳液样品转移至离心管中，4℃，10,000×g离心20 min，转移分层样品中的中层乳清至新的离心管中。（离心后样品分为三层，上层为脂质层，中层为乳清层，下层为蛋白层。脂质层应致密、稳定，若脂质层松软，不稳定，且蛋白层沉淀较多，可重复此步骤。）。

3）向乳清中加入Buffer-A，颠倒混匀离心管至呈现半透明状，再加入Buffer-B，颠倒混匀后2℃至8℃静置10 min。（静置结束后摇晃离心管，样品应呈现白色固体和透明液体混合物，若样品仍为乳白色或是未呈现混合状，可以适当加入Buffer-B至液体透明）。

【注】：试剂用量可根据此表进行等比例换算。

4）将样品于4℃，10,000×g离心10 min，收集上清液转移至50 mL过滤柱中，4℃，3000×g离心2 min。

5）收集过滤后的上清液至新的离心管中，加入和Buffer-B等量的Buffer-C颠倒混匀。

2.外泌体分离：

1）向预处理后的样品中，按照下表加入Buffer-D。

【注】：试剂用量可根据此表进行等比例换算。

2）盖紧离心管盖，涡旋振荡1 min，再放置于2℃至8℃静置1 h以上（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过24 h）。

取出装有混合液的离心管，4℃，10,000×g离心60 min，弃上清（尽可能吸净上清液），收集富含外泌体的沉淀。

将含有沉淀的离心管再次于4℃，10,000×g离心2 min，弃上清，收集沉淀（尽可能吸尽上清液）。

吸取一定量体积的1×PBS溶液均匀吹打离心沉淀物，待其充分悬浮于PBS后，将悬液转移至新的1.5 mL离心管中。

【注】加入1×PBS的量，建议根据预处理样本的体积决定，预处理样本体积：Exosome Buffer体积=125:1。

6）将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃，12,000×g离心2 min，弃沉淀，保留上清液，该上清液即富含外泌体颗粒的溶液。

【注】此时如果依然可以看到明显的沉淀，建议重复步骤6，多次离心至无明显沉淀。

7）纯化后的外泌体可于4℃保存3天，分装后于-80℃长期保存，避免反复冻融。

外泌体除菌（可选）：

获得的外泌体后期需要与细胞共培养，可以使用0.22 μm的滤器进行过滤除菌。初次尝试时，建议外泌体蛋白浓度在10-100 μg/mL内做梯度摸索，选择一个较为合适的条件。