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ROS流式分析

一、服务简介：

目前检测细胞内ROS水平常用的是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA可以自由穿过细胞膜，本身没有荧光。细胞内的酯酶可将DCFH-DA水解生成不能通过细胞膜的DCFH，这样使得探针在细胞内形成积聚。经过经细胞内ROS的氧化，DCFH可转变为有荧光的DCF，且荧光的强度与ROS的水平成正比。

二、样本要求及实验流程：

• 准备细胞：将目的细胞均匀铺至六孔板中，实验组和对照组分别做相应处理，并预设空白管（即不装载探针）。至细胞密度达到80%-95%。
• 清洗：用PBS将六孔板中细胞分别清洗1-2次，并弃去PBS。
• 消化：用胰酶将六孔板中细胞消下来，移至1.5mlEP管中，并做好标记。
• 离心：1200r，常温，离心5min。
• 探针配制：按照2μl DCFH-DA原液：3ml无血清培养基配制，上下颠倒混匀（注意避光）。
• 加入探针：弃去4中培养基，空白管加入1ml无血清培养基，其余均加入1ml配制好的探针液，并重悬细胞（注意避光）。
• 孵育：37°C避光孵育20min。
• 离心：1200r，常温，离心5min，弃去上清。
• 清洗：用1ml冷PBS清洗，1200r，常温，离心5min，弃去上清，重复2次（注意避光）。
• 上机：将细胞用500μl冷PBS重悬，并移至流式管，上机。


• 注意事项：
• 1、消化细胞时，以细胞刚好掉落为好，不可时间过长，避免过度消化造成细胞损伤而影响实验结果。
• 2、探针配置时，一般按照1：1000用无血清培养基稀释DCFH-DA（终浓度为10Μm），不同的细胞系条件有所不同，需自行摸索。
• 3、加入探针后，一定要充分混悬细胞，以保证探针完全结合。
• 4、探针孵育时，每隔3-5min需颠倒混匀。
• 5、探针孵育时间不同细胞可能会不一样，一般为20-30min。
• 6、最佳激发波长为488nm，最佳发射波长为525nm。